在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。
　　抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育，有人称之为孵育。ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有较贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触，这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。
　　这就是为什么ELISA 反应总是需要一定时间的温育。ELISA试剂盒温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
　　稳定细胞系构建服务在建立EL SA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在 43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中，以形成较多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。
　　ELISA试剂盒保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA 板置于水浴箱中，ELISA 板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。
　　若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，较后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指 20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。
　　室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。一个良好的实验操作环境可以保证ELISA试剂盒测定结果更准确。实验操作的严谨性与实验操作规范密不可分，未使用的试剂应储存于2-8℃，使用时应回温到室温（20-25℃）。切忌不同批次的试剂混合使用，要经常检查酶标仪和微量移液器的精度和准备度，这样才能保证实验的可操作性。