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生物药物研发服务鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)试剂盒微量法​测定​说明

     生物药物研发服务测定原理:
  鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同时产生NAD,通过检测340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。
  注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
  测定操作:
  1. 酶标仪预热30min,调节波长至340nm。
  2. 将配好的试剂二、三、四37℃预热5min。(注意:粉剂试剂需要自行配制)
  3. 取96孔板,依次加入60μL试剂二,60μL试剂三,60μL试剂四,20μL粗酶液,充分混匀,记录340nm处初始吸光值和37℃反应10min的吸光值A2,△A=A1-A2。
  4. 计算公式
  用96孔板测定的计算公式如下
  (1)按照样本蛋白浓度计算
  酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
  δ-OAT(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
  =321.54×ΔA÷Cpr
  (2)按照样本质量计算
  酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
  δ-OAT(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T
  =321.54×ΔA÷W
  (3)按照细胞数量计算
  酶活单位定义:每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
  δ-OAT(nmol/min /104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T
  =321.54×ΔA÷细胞数量
  (4)按照液体体积计算
  酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
  δ-OAT(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样÷T
  =321.54×ΔA
  V反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
  测定意义:
  脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同,分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是 是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。

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